4D-Omics时代
释放第四个维度的价值
基于质谱(MS)的蛋白质组学是鉴定和定量成千上万种蛋白质的首选方法。然而,由于目前的质谱仪的速度、灵敏度和分辨率有限,完全覆盖蛋白质组仍然具有挑战性。
timsTOF Pro 2使用并行累积串行碎片(PASEF®)的获取方法,以提供极高的速度和灵敏度,只需要最小的样品量,以达到蛋白质组学的新深度。
捕获离子迁移谱法(TIMS)首先是一种气相分离技术。除了高效液相色谱法(HPLC)和质谱法外,通过额外的分离维度来解决样品的复杂性,增加了化合物表征的峰容量和可信度。
同样重要的是,TIMS装置还可以积累和浓缩给定质量和流动性的离子,从而实现了灵敏度和速度的独特提高。
双tims技术可实现近100%的占空比,促进前段离子的积累,而后段离子则根据其流动性顺序释放。这个过程是平行积累的串行碎片(PASEF)®)实现碰撞截面(CCS)分析。
ccs支持的分析打开了许多进一步的分析可能性,从更大的复合识别的确定性,到有信心的库匹配和更低的错误发现率(FDRs)在大型数据集。
介绍timsTOF Pro 2质谱仪与我们最新一代的TIMS分析仪和一个完全重制的不锈钢堆叠环离子导轨(SRIG)。新的设计提供了3倍以上的离子容量。一种新的离子冷却多极,用于离子预处理和改进的离子注入到四极,以及进一步简化的离子光学,以更有效的离子转移从TIMS电池到TOF分析仪,进一步最大化离子转移和灵敏度在MS和PASEF MS/MS。
TIMS电池的独特设计意味着离子根据其流动性从TIMS分析仪的第二部分释放,而进一步进入的离子可以在TIMS分析仪的第一部分平行积累。
这种并行积累技术实现了占空比接近100%,导致几乎没有离子损失。
重新设计MS/MS技术,以满足蛋白质组学的速度要求。用捕获离子迁移谱法分离肽离子,洗脱(~ 100 ms),四极杆飞行时间(QTOF)检测,生成TIMS ms热图。在并行累积序列碎片(PASEF)®)方法采用相同的TIMS分离方法:四极杆在洗脱过程中分离出一定的离子物种,并立即转移到下一个前体。母谱和碎片谱按迁移率值排列。
PASEF®该技术可达到>100 Hz的测序速度,通过多次筛选可提高低丰度肽段的质谱质量。
PASEF®:完美适合猎枪蛋白质组学
timsTOF Pro 2由PASEF提供动力®提供了>100 Hz的测序速度,而不损失灵敏度或分辨率。这是通过同步四极分离质量窗口与特定肽包从TIMS漏斗的洗脱时间来实现的。
最小的清洁要求
许多用于蛋白质组学应用的质谱仪器在每天24小时大样本队列运行时需要每月清洗。性能退化
即使是在较短的时间内也很明显。timsTOF Pro 2优越的稳健性意味着该仪器可以连续数周24/7运行,而没有明显的灵敏度损失或其他性能指标。
“自2019年2月26个月前我们开始与TimsTOF Pro合作以来,我们已经运行了超过25000个LCMS样本,其中约5000个是未耗尽的血浆消化液。到目前为止,我们几乎没有停机时间。”
PaSER (Parallel Search Engine in Real-time)是一种硬件和软件相结合的解决方案,能够完全集成实时数据库搜索和基于样本队列的结果管理。
PaSER以不妥协的速度提供结果,包括PTM搜索。通过使用基于GPU的搜索,PaSER可以在实时或离线模式下提供相同的结果,而不需要使用简化的算法或中间体。这种不妥协的搜索速度的PaSER允许你有结果在手,在收购结束后的几秒钟,运行和完成!PaSER有效地消除了大样本队列和更大的吞吐量带来的数据分析瓶颈。
此外,还可以通过PaSER获取的数据集进行实时LFQ量化,从而实现向定量蛋白质组学的瞬时过渡。使用TIMS Viz可视化偏移质量对齐(MOMA)功能,使用户能够立即识别和表征只有4D-Omics可见和可识别的等压和近等压多肽。
DIA -PASEF将PASEF原理应用于数据独立采集,结合了DIA的优点和PASEF固有的离子效率,比传统的DIA方法更加敏感和有选择性。
TIMS分离增加了选择性,排除了单电荷前体的碎片,并通过集中噪声信号来清理样品。
利用双tims漏斗的分子量与CCS编码信息的相关性,dia-PASEF能够最可靠地识别化合物。在整个LC-MS/MS dia-PASEF运行过程中,创建了一个包含m/z、离子迁移率(CCS)、保留时间和强度的完美数据长方体。
通过强大的SRIG(堆叠环离子指南)配置和新的优化标准dda-PASEF方法,timsTOF Pro 2提供了前所未有的蛋白质组覆盖深度,在单镜头蛋白质组学。在使用Aurora-25 cm色谱柱60分钟梯度消化200 ng的HEK内胰蛋白酶后,鉴定出7000多个蛋白组和60000个肽段。
因此,timsTOF Pro 2通过数据库搜索和运行之间的匹配,无需任何光谱库,为日常细胞系蛋白质组量化实验提供了深入的蛋白质组覆盖。不同的数据库搜索策略会得到非常相似的结果。PaSER和MaxQuant在蛋白质和多肽水平上获得了相似的ID号。
与标准选择和平行反应监测(SRM和PRM)相比,PRM - pasef增加了在单一获取方法中可以靶向的肽的数量,而不影响选择性或灵敏度。
靶向质谱(MS)是一种用于蛋白质组学实验的强大技术——例如,在大样本队列中验证生物标志物候选。与数据依赖采集(DDA)和数据独立采集(DIA)相比,这提高了灵敏度。这种技术的局限性在于,在一次测试中测量的目标数量、液相色谱分离阶段的持续时间和总体灵敏度之间需要进行必要的妥协。只有通过更长时间的色谱分离或降低质谱的灵敏度和选择性,才能获得大量目标肽的完整数据。
prm-PASEF通过利用Bruker的timsTOF Pro 2的第4维分离技术提高选择性和灵敏度,增加了PASEF的速度,从而增加了前体靶标的数量,从而增加了单次捕获可靶向肽的数量。
使用低样本量的蛋白质组定量对越来越多的生物应用(如特殊细胞、罕见细胞群或细针穿刺肿瘤活检)至关重要。使用灵敏的质谱仪对如此低的样品量进行蛋白质组定量是至关重要的。通过aurora - 25cm色谱柱30分钟梯度测量20ng HeLa (Pierce)肽,PaSER——实时搜索引擎——识别出4200多个蛋白质组和近30,000个肽。
使用标准dia-PASEF方法进行数据独立采集,可在多次运行中提供可重复的识别。三种不同的dia-PASEF窗口方案允许使用aurar -25cm色谱柱在60分钟梯度中对近8000个蛋白质组和超过70000个肽序列进行定量,同时证明了定量精度。
ccs对近端磷酸化位点的定量分析
dia-PASEF在timsTOF Pro 2上的高灵敏度、测序速度和重现性甚至可以定量分析有限的样品量。磷蛋白组的无标记定量是可行的,从小鼠脑样品中获得的总蛋白低至25 μg。使用30 SPD(每天样本)evossep方法对富集的磷酸肽进行dia-PASEF分析,在3个富集重复中鉴定了多达4473个独特的磷酸肽。这些结果为针刺活检提供了进一步的应用前景,用信号转导信息补充癌症蛋白基因组学数据。结果由Stefan Tenzer教授提供。
在样本数量有限的情况下分析细胞信号
在色谱共洗脱时,由于等压性质和信号叠加,在没有CCS信息的传统蛋白质组学方法中,磷酸肽(p肽)异构体的定量是不可能的。从标准的150 μg基于二氧化钛的富集工作流程中,PASEF分析识别出27,768个磷酸肽,如右图所示,并揭示了使用迁移偏移质量对齐(MOMA)技术进行离子迁移分离的好处。自1946年鉴定出共洗脱异构体以来,20%的异构体可以通过TIMS完全分离,从而更好地了解蛋白质近端磷酸化位点。
“除了高灵敏度外,timsTOF Pro仪器的一个独特之处在于它能够解析气相中的定位磷酸化异构体,从而提供更详细的信号通路。”
仅供研究用途。不用于临床诊断程序。