timsTOF SCP

先进的离子光学和PASEF研究细胞异质性和生物学从一个单细胞
质谱蛋白质组学已经成为理解生物功能和疾病机制的现代研究的主要内容。健康或患病的组织似乎是由具有多种不同蛋白质组的细胞组成的。破译每一个细胞中的蛋白质组的挑战——细胞的异质性——是充分理解其功能的关键。
timsTOF SCP从根本上改进了离子源的概念。与并行累加串行碎片(PASEF^®，它提供了极高的速度和灵敏度，以处理单个细胞的蛋白质组或少数细胞的翻译后修饰，形态学或功能相似。

timsTOF SCP具有改进的离子源几何结构，包括1毫米毛细管识别，可将5倍以上的离子转移到额外的更高压力级离子漏斗和8级差抽真空系统。

更大的毛细管具有超高的灵敏度，附加的正交离子反射和随后的漏斗提供了一个独立的、差压泵的阶段，保持了timsTOF系列仪器所期望的系统稳定期。

timsTOF SCP提供了离子传输到源的改进，同时通过增加更高的压力真空级保持鲁棒性。这结果在离子电流几乎提高了5倍。当与Evosep One Whisper方法结合使用时，流速为100 nL/min，直径为

采用PASEF方法，与以往的高流量结果相比，Evosep One获得了约100X的灵敏度增益。这使得在真正的单细胞水平上的无偏蛋白质组学具有良好的重现性、稳健性和每个细胞大约1500个蛋白质的覆盖率首次成为可能。

捕获离子迁移谱(TIMS)是一种气相分离技术。除了高效液相色谱(HPLC)和质谱分析外，还增加了分离维度，从而解决了样品的复杂性，提高了化合物表征的峰容量和可信度。

同样重要的是，TIMS设备还可以积累和浓缩给定质量和移动性的离子，使灵敏度和速度得到独特的提高。
双tims技术可以实现接近100%的占空比，促进在前端部分的积累，而在后方部分的离子可以根据其流动性顺序释放。这种并行积累序列破碎过程(PASEF)^®)可以进行碰撞横截面(CCS)分析。

ccs支持的分析开辟了许多进一步的分析可能性，从更大的复合识别的确定性到可靠的库匹配和更低的错误发现率(FDRs)在大型数据集。

除了无偏的真正的单细胞蛋白质组学应用，timsTOF SCP还为涉及从蛋白质组中富集多肽的工作流程提供了出色的敏感性。免疫肽组学的研究始于从血浆或组织中纯化免疫肽。

由于免疫肽在这些样本中存在相对较低的丰度，timsTOF SCP对于可用材料有限的新抗原的免疫肽组学发现是理想的，如针穿刺活检。timsTOF SCP还具有将磷蛋白组学用于癌症信号通路研究的革命性应用的敏感性。

利用捕获离子迁移谱(TIMS)分离肽离子，洗脱(~ 100 ms)，在四极飞行时间(QTOF)中检测肽离子，生成TIMS ms热图。在PASEF^®方法同样的TIMS分离与四极子在其洗脱过程中分离特定的离子种类，并立即转移到下一个前体。父谱和片段谱根据迁移率值对齐。

并行累加串行碎片(PASEF^®)技术实现了>100 Hz的测序速度。使用PASEF^®通过多次筛选，提高了低丰度多肽的质谱质量。

PASEF^®:最适合猎枪蛋白质组学
timsTOF SCP由PASEF提供^®提供了>100 Hz的排序速度而不失去灵敏度或分辨率。这是通过同步四极隔离质量窗口与从TIMS漏斗的特定肽包的洗脱时间以及碰撞单元中的碰撞能量来实现的。

timsTOF SCP允许在超过100 Hz的测序速度和不受损害的蛋白质组深度下，以最小的样本负载(<200 ng)分析数百个样本。这改变了蛋白质组学的研究方式，但增加的数据需要一个新的数据分析水平。

数据分析是许多工作流中常见的瓶颈。现代分析方法的结果是由timsTOF SCP生成数百行数据。Bruker引入了实时数据库搜索功能——并行数据库实时搜索引擎(PaSER)，消除了这一障碍。使用PaSER，一旦LC-MS运行完成，结果是可用的-有效运行和完成。

开放文件数据格式允许研究人员直接使用原始数据，并使用他们选择的行业领先软件。

Bruker公司的MaxQuant软件已被用于管理由保留时间、离子迁移率、质量和信号所跨越的空间中的四维(4D)特征

强度。这有利于多肽、蛋白质和翻译后修饰的鉴定和定量。

peak Studio结合了从头测序与传统的数据库搜索，并优化处理timsTOF原始数据。

支持ccs的可靠标识分析
timsControl允许自定义dia-PASEF窗口方案的重点

兴趣离子。调整质量隔离宽度，TIMS范围和周期时间允许调整dia-PASEF不同的色谱方法。

结合低流动液相色谱与低语Evosep一个系统的高灵敏度dia-PASEF timsTOF SCP,超过2000个蛋白质被确定从1500年500 pg细胞消化和蛋白质被确定从250年pg,展示所需的灵敏度真正的单细胞蛋白质组学。从250 pg中鉴定出的蛋白质涵盖了约4个数量级的丰度范围，可以在单细胞水平上进行蛋白质组学定量分析。

了解TME及其浸润免疫细胞可被认为是影响疾病进展、治疗反应和患者生存的关键步骤。由于其高灵敏度，timsTOF SCP使得激光捕获显微解剖(LMD)从FFPE组织样本中切除的细胞具有足够的蛋白质组深度。一个典型的工作流程如图所示。

细胞标记物被用来识别肿块中的黑色素瘤癌细胞和那些与基质密切相关的细胞，随后通过LMD和timsTOF SCP仪器的无偏倚4d蛋白质组学分析分离这两个群体。

关键发现:富集分析显示中央和外周黑素瘤细胞之间的差异调节蛋白具有疾病分型的潜力，以指导临床决策。
结果由Matthias Mann教授提供(doi:https://doi.org/10.1101/2020.12.22.423933）